熱應激建鯉飼料中吡啶甲酸鉻的適宜添加量
王晶晶劉文斌*徐維娜王瑩張微微
(南京農業(yè)大學動物科技學院，江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室，南京210095)*通訊作者:劉文斌，教授，博士生導師，E-mail:wbliu@njau.edu.cn摘要:本研究旨在探討熱應激建鯉(Cyprinuscarpiovar．Jian)飼料中吡啶羧酸鉻的適宜添加量。試驗選取初始均重為(32.88±0.17)g的建鯉360尾，隨機分為6組(每組4個重復，每個重復15尾魚)，分別投喂在基礎飼料中添加不同水平吡啶羧酸鉻的試驗飼料，各組飼料Cr3+理論添加量分別為0、300、600、900、1200和1500μg/kg。試驗在室內可控溫循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，馴化期10d(26℃)，正試期60d(“常溫—高溫—常溫”應激模式:20d，26℃;20d，31℃;20d，26℃)。結果表明:1)飼料中添加600和900μg/kg吡啶羧酸鉻(以Cr3+計，下同)可顯著提高建鯉的增重率和蛋白質效率，降低飼料系數(shù)(P＜0．05)。與對照組相比，當添加量達到1500μg/kg時，增重率下降3．4%(P＞0．05)。隨著飼料中吡啶羧酸鉻添加量的升高，建鯉肝體比呈上升趨勢，900、1200和1500μg/kg添加組肝體比顯著高于對照組(P＜0．05)。2)飼料中吡啶羧酸鉻的添加量對建鯉肌肉粗脂肪、灰分和水分含量的影響不顯著(P＞0．05)，對肝胰臟粗脂肪含量也無顯著影響(P＞0．05)，但300和600μg/kg添加組肌肉和肝胰臟粗蛋白質含量較對照組顯著升高(P＜0．05)。3)飼料中添加600μg/kg吡啶羧酸鉻可顯著提高建鯉血清中白蛋白含量(P＜0．05)，添加1500μg/kg吡啶羧酸鉻可顯著降低血清總蛋白和白蛋白含量(P＜0．05)，添加600、900、1200和1500μg/kg吡啶羧酸鉻可顯著降低血清中膽固醇含量(P＜0．05)，添加900、1200、1500μg/kg吡啶羧酸鉻可顯著降低血清中甘油三酯含量(P＜0．05)。綜上所述，在飼料中添加600μg/kg吡啶羧酸鉻(飼料中Cr3+實際含量為912．94μg/kg)有較好的抗熱應激效果，可促進熱應激建鯉生長并提高其肌肉粗蛋白質含量。
關鍵詞：吡啶羧酸鉻、熱應激;建鯉、適宜添加量
中圖分類號：S963
文獻標識碼：A
文章編號：1006-267X(2011)07-1209-08
在水產動物的整個生命過程當中，環(huán)境溫度是最重要的外界因素之一，影響著水生動物的生存、生長和繁殖，魚類在長期進化過程中都有其適宜的環(huán)境溫度。鯉魚是溫水性魚類，其適宜生長的水溫為22～28℃，溫度過高或過低都會對魚類產生應激。Hans［1］認為應激是具有適應意義的生理反應，目的是維持內穩(wěn)態(tài);如果機體不能適應所受的應激，內穩(wěn)態(tài)就會被破壞，從而導致機體抵抗力下降、生長緩慢并引起多種病變。鉻是動物必需的微量元素，Cr3+作為葡萄糖耐量因子(GTF)的活性成分，與胰島素之間存在協(xié)同作用［2］，共同參與體內三大營養(yǎng)物質的代謝［3］。劉太亮等［4］研究報道，飼料中添加吡啶甲酸鉻能提高草魚對葡萄糖的耐受量，促進草魚生長。此外，還有研究表明，鉻可以提高動物機體抗應激能力［5］;在飼料中添加適宜水平的鉻能夠促進魚類的生長，降低魚的應激反應，提高魚的運輸成活率和運輸后暫養(yǎng)成活率［6］。
關于鉻對熱應激畜禽營養(yǎng)的調控作用研究已開展較多。張敏紅等［7］研究發(fā)現(xiàn)，給飼養(yǎng)于高溫環(huán)境中的肉雞補充吡啶甲酸鉻，能夠抑制由高溫引起的蛋白質分解過程，緩解熱應激;王剛等［8］研究證實，在基礎飼糧中添加吡啶羧酸鉻能提高熱應激肉仔雞的生產性能，改善胴體品質。目前，有關鉻對熱應激魚生長性能和血液生化指標的影響報道較少。夏季水溫過高，超過魚類生長的適宜水溫，易引起魚類熱應激，導致魚類攝食量減少、生長速度減慢、抵抗力下降等。本試驗選取吡啶羧酸鉻作為熱應激調節(jié)劑，通過在建鯉基礎飼料中添加不同劑量的鉻，測定熱應激條件下建鯉生長指標、形體指標及血清生化指標，旨在探討吡啶羧酸鉻對建鯉的抗熱應激作用，為其在水產養(yǎng)殖中的合理添加和應用提供參考。
1、材料與方法
1．1試驗材料
試驗用吡啶羧酸鉻由武漢神舟化工有限公司生產，飼料級，吡啶羧酸鉻含量≥9．9%，Cr3+含量≥1．23%。
試驗用建鯉購于中國水產科學院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，體質健壯、規(guī)格整齊，均重為(32．88±0．17)g。
1．2試驗飼料
根據(jù)鯉魚配合飼料營養(yǎng)標準(SC/T1026—1998)配制基礎飼料，在基礎飼料中添加不同水平的吡啶羧酸鉻，配制成試驗飼料。試驗飼料中Cr3+的理論添加量分別為0(對照組)、300、600、900、1200和1500μg/kg(實測值分別為308．50、581．52、912．94、1209．56、1533．48、1794．34μg/kg)。
基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料粉碎后過80目篩，采用逐級混合法添加微量組分，充分混勻后用小型制粒機制成顆粒料。制粒溫度為45～50℃，粒徑為1mm，放置在室溫中晾干后保存于4℃冰箱中備用。
1．3試驗設計與飼養(yǎng)管理
試驗分為6組，每組4個重復，每個重復15尾魚，在南京農業(yè)大學水產動物營養(yǎng)與生態(tài)學研究室進行。養(yǎng)殖系統(tǒng)為室內可控溫循環(huán)流水系統(tǒng)，共24個水族箱，每個水族箱(200L)為1個重復。試驗從2010年6月25日開始至2010年9月2日結束，共70d，其中馴化期10d(水溫為26℃)，正試期60d。整個試驗期采取自然光照(晝夜比為10∶14)，白天的平均光照強度是1250lx。
正試期內試驗采用“常溫—高溫—常溫”應激模式，即分為3個階段，第1階段20d，水溫控制在26℃;第2階段20d，采用程序升溫使循環(huán)系統(tǒng)內的水溫每天升高1℃，5d后升高至31℃并保持15d;第3階段20d，采用程序降溫使循環(huán)系統(tǒng)內的水溫每天降低1℃，5d后降低至26℃并保持15d。試驗期內，每天投喂試驗飼料3次(投喂時間分別為08:30、12:30和16:30)，日投喂量占魚體重的3%～5%。投喂時記錄投喂量，30min后觀察并記錄攝食情況，然后吸出殘餌。每天定時排污，并在09:00和13:00各測1次水溫。試驗期間保持水體pH7．5～8．0、溶氧＞5．0mg/L、氨氮＜0．4mg/L、亞硝態(tài)氮＜0．06mg/L、總氮＜1．5mg/L、總磷＜0．8mg/L，以保證水質優(yōu)良。
1．4樣品采集
正試期結束后，禁食24h，將各水族箱中的魚用濃度為100mg/L的MS－222麻醉后稱重，然后從每箱中隨機選取5尾魚，測定魚體單體體重、體長后用注射器尾靜脈采血。采集的血液置于預先制好的肝素抗凝管中，于4℃下3700r/min離心10min，收集血清，標號后分裝于－70℃保存?zhèn)溆谩⒉裳蟮聂~首先剖開腹腔，剝離出肝胰臟，稱重后放入離心管于－70℃保存?zhèn)溆?然后將腹腔內其他內臟剝離，稱空殼重;最后去鱗，取側線以上的中間部分的背肌，去皮去骨后裝袋－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1．5指標測定
1.5.1生長指標和形體指標
增重率(WGR，%)=100×(Wt－W0)/W0;
飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt－W0);
蛋白質效率(PER，%)=100×(Wt－W0)/(F×P);
肝體比(HSI，%)=100×Wh/Wt;
肥滿度(CF，%)=100×Wt/L3t;
臟體比(VSI，%)=100×(Wt－Wv)/Wt。
式中:W0為初始體重(g);Wt為終末體重(g);Wh為肝胰臟重(g);Wv為空殼重(g);t為養(yǎng)殖天數(shù)(d);F為平均攝食量(g);P為飼料中粗蛋白質含量(%);Lt為魚終末體長(cm)。
1.5.2飼料、肌肉、肝胰臟中常規(guī)營養(yǎng)成分
飼料和肌肉中常規(guī)營養(yǎng)成分采用AOAC(1995)［9］的方法測定，即水分采用105℃烘干法測定;粗蛋白質采用凱氏微量定氮法測定;粗脂肪采用索氏抽提法測定;粗灰分采用550℃灼燒法測定;總能采用氧彈測熱儀直接測定。
肝胰臟中粗蛋白質亦采用凱氏微量定氮法測定，粗脂肪則采用Folch等［10］的方法測定，具體測定步驟如下:首先取1．25g鮮組織樣，加3．75mL氯仿－甲醇混合液(V氯仿∶V甲醇=1∶2)，漩渦震蕩10～15min;然后加入1．25mL氯仿，震蕩混合1min，再加入1．25mL蒸餾水，混合震蕩1min，3700r/min離心10min，收集底層液相于離心管中;再加入1．88mL氯仿到殘渣中，漩渦震蕩，3700r/min離心10min，將底層液相溶液與上步收集的底層液相溶液混合，持續(xù)通氮氣干燥樣品后稱重。
1.5.3血清生化指標
血清總蛋白、白蛋白、甘油三酯、總膽固醇含量的測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，其中總蛋白采用考馬斯亮蘭法［11］，白蛋白采用溴甲酚綠比色法［12］，甘油三酯采用酶法［13］，總膽固醇采用膽固醇氧化酶－過氧化物酶法［12］。
1．6數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，采用SPSS16．0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較，差異顯著性水平設為P＜0．05。
2、結果
2．1
吡啶羧酸鉻添加量對熱應激建鯉生長指標的影響經(jīng)過70d的試驗，建鯉的各項生長指標見表2。隨著吡啶羧酸鉻添加量的升高，建鯉終末體重、增重率和蛋白質效率呈先上升后降低趨勢，飼料系數(shù)則呈先下降后升高趨勢。
與對照組相比，飼料中吡啶羧酸鉻添加量為600和900μg/kg(以Cr3+計，下同)時，增重率分別提高了20．12%(P＜0．05)和12．57%(P＜0．05)，當添加量達到1500μg/kg時，增重率下降了3．4%(P＞0．05)。600μg/kg添加組蛋白質效率最高，其次是900μg/kg添加組，上述2組均顯著高于對照組和1500μg/kg添加組(P＜0．05)。600μg/kg添加組的飼料系數(shù)最低，其次是900μg/kg添加組，再次是300μg/kg添加組，上述3組均顯著低于對照組和1500μg/kg添加組(P＜0．05)，但3組間差異不顯著(P＞0．05)。
2．2
吡啶羧酸鉻添加量對熱應激建鯉形體指標的影響由表3可知，飼料中吡啶羧酸鉻添加量對建鯉肥滿度無顯著影響(P＞0．05)。隨吡啶羧酸鉻添加量的增加，建鯉肝體比呈上升趨勢，對照組與300和600μg/kg添加組之間差異不顯著(P＞0．05)，但顯著低于900、1200和1500μg/kg添加組(P＜0．05)，各添加組之間差異不顯著(P＞0．05)。飼料中添加300、600和900μg/kg吡啶羧酸鉻對建鯉臟體比無顯著影響(P＞0．05)，當添加量大于900μg/kg時，建鯉臟體比較對照組顯著下降(P＜0．05)。
2．3
吡啶羧酸鉻添加量對熱應激建鯉肌肉和肝胰臟中常規(guī)營養(yǎng)成分的影響由表4可見，建鯉肌肉中粗脂肪、灰分和水分含量不受吡啶甲酸鉻添加量的影響，各組間差異均不顯著(P＞0．05)。飼料中添加300和600μg/kg吡啶羧酸鉻顯著提高了肌肉中粗蛋白質含量(P＜0．05)，添加量為900、1200和1500μg/kg的各組肌肉中粗蛋白質含量高于對照組，但差異不顯著(P＞0．05)。建鯉肝胰臟中粗脂肪含量也不受吡啶羧酸鉻添加量的影響，各組間差異不顯著(P＞0．05)。飼料中吡啶羧酸鉻添加量為300和600μg/kg時，建鯉肝胰臟中粗蛋白質含量較對照組分別提高了10．84%(P＜0．05)和10．66%(P＜0．05)，添加量為900、1200和1500μg/kg的各組肝胰臟中粗蛋白質含量高于對照組，但差異不顯著(P＞0．05)。
2．4
吡啶羧酸鉻添加量對熱應激建鯉血清生化指標的影響由表5可知，吡啶羧酸鉻的添加量對建鯉血清總蛋白和白蛋白含量產生了影響，其均隨吡啶羧酸鉻添加量的升高先上升后下降。600μg/kg添加組的血清總蛋白含量最高，較對照組升高了4．37%(P＞0．05)，1500μg/kg添加組的血清總蛋白含量最低，顯著低于對照組和300、600、900μg/kg添加組(P＜0．05)。600μg/kg添加組的血清白蛋白含量最高，顯著高于對照組和900、1200和1500μg/kg添加組(P＜0．05)，1500μg/kg添加組的血清白蛋白含量最低，顯著低于其他各組(P＜0．05)。建鯉血清膽固醇和甘油三酯含量均隨吡啶羧酸鉻添加量的升高而降低。1200μg/kg添加組的血清膽固醇含量最低，其次是1500μg/kg添加組，上述2組均顯著低于其他各組(P＜0．05);900μg/kg添加組的血清膽固醇含量較對照組和300μg/kg添加組分別下降了12．4%(P＜0．05)和8．37%(P＜0．05);600μg/kg添加組的血清膽固醇含量與300μg/kg添加組相比差異不顯著(P＞0．05)，但顯著低于對照組(P＜0．05)。飼料中添加1500μg/kg吡啶羧酸鉻能顯著降低建鯉血清甘油三酯的含量(P＜0．05)，900和1200μg/kg添加組的血清甘油三酯含量均顯著低于對照組和300μg/kg添加組(P＜0．05)，600μg/kg添加組的血清甘油三酯含量與對照組以及300、900、1200μg/kg添加組相比差異均不顯著(P＞0．05)。
3、討論
3．1吡啶甲酸鉻對熱應激建鯉生長性能的影響
應激能引起機體額外能量需求，這種能量需求要通過機體動員能源物質來滿足，因此，在應激狀態(tài)下用于生長和維持健康的物質和能量減少，導致魚類生長減緩、免疫力下降、飼料利用率下降。研究表明，當動物遭受應激時糖代謝加強，組織中鉻被動員參與反應而排出體外，動物需要及時從飼糧中補充鉻，以減少機體鉻不足帶來的危害［14］;在草魚飼料中添加吡啶甲酸鉻能促進草魚生長，提高糖的耐受量［4］;在團頭魴基礎飼料中添加600μg/kg吡啶羧酸鉻，可獲得較好的生長性能，同時能提高運輸成活率和運輸后暫養(yǎng)成活率，增強團頭魴的抗應激能力［5］。本試驗結果表明，在飼料中添加600μg/kg的吡啶羧酸鉻能顯著提高熱應激建鯉的增重率、特定生長率和蛋白質效率，降低飼料系數(shù)，與上述報道基本一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，飼料中添加低劑量吡啶羧酸鉻能提高建鯉的增重率和特定生長率，促進建鯉生長，但是當添加量達到1500μg/kg時，與對照組相比，增重率和特定生長率降低，飼料系數(shù)升高。藺玉華等［15］的研究證實，飼料中鉻添加濃度過高會導致魚出現(xiàn)負生長，引起毒害作用，與上述結果一致。這是因為長期添加高劑量的吡啶羧酸鉻，會突破動物機體鉻的儲存和調節(jié)能力，導致體內鉻含量急劇上升，干擾了其他營養(yǎng)成分的吸收和利用，不僅會降低動物的生產性能，還可能引起細胞毒性和DNA毒性。
3．2
吡啶羧酸鉻對熱應激建鯉形體指標及組織營養(yǎng)成分的影響形體指標能反映魚體的健康狀況、營養(yǎng)水平等。對于相同規(guī)格的鯉魚，肥滿度升高表示鯉魚體型好、增重快。肝胰臟是魚類中間代謝的重要器官，同時也是魚類重要的營養(yǎng)儲存器官，魚類的肝體比是對長期和短期營養(yǎng)方式都很敏感的指標，隨著營養(yǎng)發(fā)生變動肝臟重量也會發(fā)生明顯的變化［16］。高溫使機體能量供應不足而導致機體營養(yǎng)不良，進而引起魚類生理機能的紊亂。本試驗結果表明，當吡啶羧酸鉻添加量低于900μg/kg時，各添加組的肥滿度和肝體比與對照組相比差異不顯著;當添加量超過900μg/kg時，魚體肥滿度有下降趨勢，肝體比顯著增加，臟體比顯著下降。上述結果說明，吡啶羧酸鉻添加量低于900μg/kg時，能改善熱應激建鯉的營養(yǎng)狀況，而吡啶羧酸鉻添加劑量過高導致肝臟明顯偏大。結合生長指標得出，建鯉長期攝食含高濃度吡啶羧酸鉻的飼料，不僅生長性能下降，還對魚類肝臟造成了損害。
鉻能夠促進氨基酸進入細胞，提高蛋白質的合成能力，還參與核酸代謝、維持核酸的穩(wěn)定和完整。這是由于鉻可通過增強胰島素功能來促進蛋白質的合成，起到了類似于營養(yǎng)再分配劑的“定向沉淀”作用，通過改變機體養(yǎng)分的流向，使營養(yǎng)物質趨向肌肉而遠離脂肪［17］。Ward等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加200μg/kg吡啶甲酸鉻可增加胴體蛋白質含量，減少脂肪含量。潘慶等［19］認為，在奧尼羅非魚飼料中添加煙酸鉻，對肌肉和肝胰臟營養(yǎng)成分無顯著影響。本研究結果發(fā)現(xiàn)，飼料中添加不同水平的吡啶甲酸鉻對熱應激建鯉背部肌肉水分、灰分、粗脂肪含量影響不顯著，但可顯著提高粗蛋白質含量。此外，吡啶羧酸鉻不僅能提高肌肉中粗蛋白質含量，還能提高肝胰臟中粗蛋白質含量，說明飼料中添加的鉻增強了肝臟合成蛋白質的能力。本研究結果與潘慶等［19］的研究結果有一定的差異，造成這可能是由試驗動物以及選用的鉻源不同造成的。
3．3
吡啶羧酸鉻對熱應激建鯉血清生化指標的影響桂丹等［20］的研究表明，水溫在2h內由常溫(25℃)升至高溫(31℃)，并維持24h，熱應激對異育銀鯽造成了損傷。建鯉屬于溫水性魚類，其適宜生長水溫為22～28℃，本研究水溫由常溫(26℃)升至高溫(31℃)，并維持高溫15d，建鯉發(fā)生了熱應激。
血清總蛋白及其中的白蛋白能夠反映動物的營養(yǎng)狀況，良好的營養(yǎng)狀況可使血清中蛋白質維持在一個較高的水平。Amoikon等［21］認為，補充有機鉻可增強氨基酸合成蛋白質的能力，從而降低氨基酸代謝成尿酸隨尿排出體外的數(shù)量，提高血清總蛋白含量。藺玉華等［15］研究表明，在飼料中添加0．5mg/kg六水氯化鉻，鯉的血清總蛋白含量雖然降低，但仍在正常范圍之內，降低的原因可能是由于鉻促使氨基酸向組織蛋白轉化的緣故，因此其相對生長率高于對照組。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加適量吡啶羧酸鉻能提高血清中總蛋白含量，其中600μg/kg添加組比對照組提高了4．4%，當吡啶甲酸鉻添加量達到1500μg/kg時，血清中總蛋白含量顯著低于對照組;隨著飼料中吡啶羧酸鉻添加量的升高，建鯉血清中白蛋白含量先升高后降低，添加量為600μg/kg時血清白蛋白含量最高。肝臟是血液蛋白質合成的主要器官，補充鉻能促進肝臟中甘氨酸、絲氨酸、蛋氨酸的利用，增強蛋白質合成，鉻添加量過高時，可引起肝臟病變或中毒，引起肝臟合成蛋白功能減弱，而使血清總蛋白含量降低。本試驗中，600μg/kg添加組的血清總蛋白和白蛋白含量都是最高的，表明此添加劑量的吡啶羧酸鉻使建鯉蛋白質合成代謝能力加強，肌肉沉積增加，由高溫引起的蛋白質分解過程受到了抑制，起到了緩解高溫應激的作用。
Cr3+參與動物機體膽固醇的平衡調節(jié)，影響膽固醇在動物肝臟中的合成與清除，能夠促進脂肪的重分配，提高血液中高密度脂蛋白的含量，降低血清中膽固醇水平，同時，鉻還能促進脂肪組織的水解，生成的脂肪酸通過β－氧化途徑氧化供能，為其他組織的正常代謝或生理功能的發(fā)揮提供所需的能量。研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚飼料中添加0．5mg/kg的氯化鉻，血清甘油三酯含量顯著降低［16］;蛋雞飼料中添加吡啶甲酸鉻，血清總膽固醇含量顯著降低［22］。本研究結果和上述結果相一致，即在飼料中添加吡啶羧酸鉻能降低血清中膽固醇和甘油三酯的含量。
4、結論
本試驗條件下，在飼料中添加600μg/kg吡啶甲酸鉻(飼料中Cr3+實際含量為912．94μg/kg)有較好的抗熱應激效果，可促進熱應激建鯉生長并提高其肌肉中粗蛋白質含量。
參考文獻：22篇（略）
【本文發(fā)表于《動物營養(yǎng)學報》，2011，23(7)：1209-1216】
